ELISA試劑盒方法現在已經(jīng)被廣泛的應用于各種抗原和抗體測定。拋開(kāi)試劑盒本身質(zhì)量外，我們在實(shí)驗中也有很多因素都會(huì )影響試驗的正常結果。其中最常出現的問(wèn)題是顯色淡，靈敏度偏低、重復性不佳、假陽(yáng)性結果和假陰性結果，不管出現什么樣的結果都會(huì )直接影響我們的實(shí)驗結果。下面來(lái)分析ELISA試劑盒實(shí)驗非正常檢測結果產(chǎn)生的常見(jiàn)原因，并分析其解決辦法，以提高檢測質(zhì)量。

1、方法學(xué)的影響
ELISA試劑盒測定模式包括以下幾種: 雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM 抗體捕捉法、競爭抑制法, 其中競爭抑制法因受操作時(shí)差所引起的競爭等因素的影響, 結果重復性較差, 質(zhì)量較難控制。
2、試劑因素
試劑的選擇 檢測的原理均基于抗原抗體反應。由于該反應過(guò)程受多種因素的影響, 如普遍存在基質(zhì)效應、交叉反應等, 因而檢測結果難以溯源, 不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號間結果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測的水平, 因此在引入新項目之前必須對試劑進(jìn)行嚴格的評估。試劑的評估有以下幾個(gè)步驟: (1) 確定開(kāi)展該項目的必要性; (2) 了解該項目現有的檢測方法和原理; (3) 在了解試劑的組成基礎上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較,判斷標準參考方法或參考物質(zhì), 其次為臨床的滿(mǎn)意度及機構的報告如各級室間質(zhì)量評價(jià)、CDC 報告等; (4) 定期對檢測結果進(jìn)行追蹤反饋直至最終認可該試劑。
3、樣本因素
標本干擾因素包括內源性干擾因素和外源性干擾因素,前者包括類(lèi)風(fēng)濕因子、補體、異嗜性抗體、自身抗體等, 后者包括標本溶血、標本被污染、標本貯存時(shí)間過(guò)長(cháng)、標本凝固不全、冷凍標本的反復凍融等。其中外源性干擾因素是我們在檢測過(guò)程中可以避免也是必須避免的因素, 而避免內源性因素的干擾則主要通過(guò)選擇合適的試劑盒。在臨床中遇到少見(jiàn)的疑難病例時(shí)應當考慮到內源性干擾因素的存在。以下對外源性干擾因素進(jìn)行簡(jiǎn)要說(shuō)明:
標本溶血 要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團, 其具有類(lèi)過(guò)氧化物的活性, 因此, 在以辣根過(guò)氧化物酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 為標記酶的ELISA 測定中, 如果血清標本中血紅蛋白濃度較高, 則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相, 從而與后面加入的底物反應顯色。
ELISA試劑盒操作步驟復雜, 操作不當將引起較大的誤差。以下敘述各個(gè)步驟中的影響因素。加樣器是一種比較精密的工具, 其在長(cháng)時(shí)間使用時(shí)會(huì )因機械磨損或者推動(dòng)桿內附著(zhù)血痂等原因造成加樣不準, 尤其是對于樣本量較大的臨床實(shí)驗室, 因此必須定期對加液器進(jìn)行維護和校準。每次加不同的標本時(shí)均需更換吸嘴, 以免發(fā)生交叉污染。加樣時(shí)速度不可太快, 避免將標本加在孔壁上部, 并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)還應當注意操作時(shí)差對結果的影響, 操作時(shí)差是指加入標本、試劑及混勻時(shí)間的差異。操作時(shí)差在每個(gè)實(shí)驗中都存在, 尤其是手工操作, 日常檢測標本多達幾百個(gè),從加入第一個(gè)標本到最后一個(gè)標本, 需幾十分鐘, 加入試劑及混勻等均存在著(zhù)前后時(shí)間差異, 使抗原抗體反應和酶促反應時(shí)間不一致, 操作時(shí)差對競爭法檢測的結果影響更大, 在加酶結合物和底物時(shí)可用定量多道。
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