產(chǎn)品及特點(diǎn)：

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由 CSF 病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，以稽留高熱、出血和高死亡率為主要特征，被世界動(dòng)物衛生組織列為必須呈報的動(dòng)物疫病。目前，該病主要流行于亞洲、歐洲和南美洲，在家豬和野豬中廣泛傳播，給養豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。近年來(lái)，CSF 在中國的流行和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大變化，在臨床表現上趨于復雜化，出現了所謂“非典型豬瘟”、“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”，在病理剖檢上也常常不同于典型豬瘟的病理變化，給獸醫臨床診斷造成了較大困難。本產(chǎn)品是基于染料法熒光定量 PCR 原理開(kāi)發(fā)，專(zhuān)門(mén)檢測豬瘟病毒疫苗株的試劑盒。

1. 一站式，用于不需要單獨準備每種成分，包括引物和對照。

2. 根據豬瘟病毒疫苗株的保守基因序列設計的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規 RT-PCR 高 10-100 倍，可以達到至少 1000 拷貝/反應。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內完成，不需要中間轉移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。

運輸及保存：

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

陽(yáng)性對照需要因易污染其他成分需要單獨放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對照，只提供 DNA 片段作為陽(yáng)性對照。

自備試劑：

樣品 RNA。

使用方法：

一、稀釋陽(yáng)性對照：

以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例，由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進(jìn)行。為增加產(chǎn)品穩定性和避免擴散傳染性病原。

1. 標記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專(zhuān)用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同)。

2. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對照。放冰上待用。

3. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對照。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對照。放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備：

5. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽(yáng)性對照)，一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對照)?？梢杂?10μL 上步制備的陽(yáng)性對照梯度稀釋液中的第 4 號(濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬(wàn)拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對照(加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ?。

6. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數病毒 RNA 提取試劑盒兼容。

三、設置 RT-PCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）：

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照，6 個(gè)用于標準曲線(xiàn)。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照(用水做模板)，1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對照(用第 4 號陽(yáng)性對照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個(gè)標曲反應縮減成 1 個(gè)，其余不變。

8. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽(yáng)性對照，陽(yáng)性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加)：

成分

注： 需使用 ROX 染料 I 的機型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。

需使用 ROX 染料 II 的機型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。

不需要使用ROX 的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。

9. 上機后按下面參數進(jìn)行 RT-PCR(參數可能會(huì )因儀器不同而需優(yōu)化)。

按儀器預設程序進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析

四、數據處理：

10. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽(yáng)性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線(xiàn)。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線(xiàn)上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

11. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對照必須有熒光對數增長(cháng)，有典型擴增曲線(xiàn)，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實(shí)驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。
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